分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子

發(fā)生岐化作用，生成 H₂O₂ 和 O₂。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H₂O₂ 主要生成

酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

測(cè)定原理：

通過(guò)氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O^2-.)，O^2-.可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲

臜，后者在 560nm 處有吸收；SOD 可清除 O^2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液藍(lán)色越深，

說(shuō)明 SOD 活性愈低，反之活性越高。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 15mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 350μL×1 支，4℃保存；

試劑三：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提

取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超 聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次 ）；

8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，

加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 560nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍，用多少配多少。（試劑二和蒸餾水 1：1 稀釋）

3、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完），再用蒸餾水稀釋 4 倍，用多少

配多少（試劑四和蒸餾水 1：3 稀釋）。

4、 測(cè)定前將試劑一、三和四在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）水浴 5min 以上。

5、 樣本測(cè)定（在 EP管中依次加入下列試劑）：

試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管

試劑一 240 240

試劑二 6 6

樣本 90

蒸餾水 90

試劑三 180 180

試劑四 510 510

充分混勻，室溫靜置 30min 后，加入 1mL 玻璃比色皿，560nm 處測(cè)定各管吸光值 A。

注意事項(xiàng)：

1、試劑二為酶，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置。

2、對(duì)照管只需要做一管。

3、若對(duì)照管吸光值大于 2，建議將試劑二用蒸餾水稀釋 7 倍后使用（10μL 試劑二原液+60μL

蒸餾水）。

4、SOD為什么有的樣本測(cè)定管大于對(duì)照管，對(duì)照管數(shù)值在什么范圍？

對(duì)照管的范圍是 0.8-2。對(duì)照管吸光值過(guò)低可能是（1）試劑二或試劑四沒(méi)有現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2)沒(méi)有按順序加試劑；（3）反應(yīng)時(shí)間不夠，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間 30min可以延長(zhǎng)

到 40min）。對(duì)照管吸光值過(guò)高可能是試劑二未按操作說(shuō)明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。

若出現(xiàn)測(cè)定管大于對(duì)照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般

將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10倍后再測(cè)，通常可以使測(cè)定正常。計(jì)算公式中

乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。