主要用途

    組織SRC激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到SRC磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中SRC活性的經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中SRC激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1． 手術取出動物組織，并秤重500毫克組織重量 

2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入XX毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （選擇步驟）抽去清理液

5． 移入到一個液氮凍存管

6． 即刻放進液氮罐過夜

7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8． 放進一個15毫升錐形離心管

9． 加入置于冰槽里的XX微升裂解液（Reagent B） 

10． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）

12． 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g

13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

15． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數6次（共5分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取XX微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入XX微升酶促液（Reagent D）

3． 加入XX微升反應液（Reagent E）

4． 加入XX微升底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘

6． 加入XX微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘

四、 樣品測定

1． 移取XX微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入XX微升酶促液（Reagent D）

3． 加入XX微升反應液（Reagent E）

4． 加入XX微升底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘

6． 加入5微升待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘

五、 計算樣品活性 單位＝微摩爾NADH/分鐘

六、 酶標板測定

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取XX微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入XX微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入XX微升反應液（Reagent E）

5． 分別加入XX微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動96孔酶標板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入XX微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動酶標板

10． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數

11． 活性計算：

注意事項

1． 本產品為25次操作，包括背景操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關重要 

6． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光譜測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續30分鐘

8． 光譜測定后，比色皿須清洗*

9． 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性

10． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

12． 可以使用SRC抑制劑（4-(4′-Phenoxyanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline；IC50=44納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照

13． Src激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

14． 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品